Сборка экспрессионных векторов для индукции транслокаций в геноме клеток человека
В современном мире как никогда ранее стоит проблема вторичных лейкозов. Эта разновидность рака крови возникает как побочный эффект химиотерапии при лечении других разновидностей рака. Так как сейчас чаще достижима стабильная ремиссия, вторичные лейкозы успевают проявиться. Они вызваны действующим компонентом терапии — этопозидом, который вызывает разрывы в ДНК вследствие нарушения работы фермента ДНК-топоизомеразы II. В случае неправильной сшивки между генами MLL1 и AF9 (транслокации) клетка начинает бесконтрольно делиться, и возникает вторичный лейкоз. В связи со все большими масштабами данного заболевания, необходимо найти методы его предотвращения путем снижения возможности таких хромосомных перестроек. Для этих исследований требуется модель заболевания: линия человеческих клеток с возможностью индукции транслокаций по сигналу извне. Такую модель возможно создать, интегрировав в геном клетки генетическую конструкцию, которая несет гены всех необходимых молекулярных инструментов.
- Спроектировать и сконструировать генетический вектор для создания клеточной модели вторичного лейкоза.
- Изучить литературу по теме исследования и выявить точные места хромосомных перестроек в клетках вторичного лейкоза.
- Подобрать соответствующие данным местам гидовые РНК для внесения разрезов при помощи системы CRISPR/Cas9.
- Провести встраивание гена РНК-гида в плазмиду с помощью рестрикционного клонирования
- Подобрать праймеры для контроля модификации плазмиды.
- Увеличить количество копий данного вектора путем репликации в бактериальных клетках.
- Проверить работоспособность генетической конструкции в эукариотических клетках.
- Изучены статьи по теме вторичных лейкозов и выявлены точные места происходящих перестроек.
- При помощи онлайн-программы отобраны комбинации РНК-гидов, приводящих к перестройкам.
- Собраны плазмидные векторы, несущие гены РНК-гидов.
- Работоспособность системы протестирована при помощи котрансфекции клеток культуры HeLa собранными плазмидами и затем с помощью ПЦР на наличие перестроившихся участков.
- Ломов Николай Андреевич
- Вьюшков Владимир Сергеевич
