Динамика репликации центриолей в клеточном цикле
Центросома – клеточная органелла, которая состоит из двух центриолей и перицентриолярного матрикса и играет важную роль в делении клетки, так как служит организатором микротрубочек веретена деления. Они входят в состав центра организации микротрубочек (ЦОМТ) и образуют полюса на концах клетки, где заканчиваются микротрубочки веретена деления. Соответственно, для того чтобы обеспечить нормальное деление клетки, кроме репликации ДНК, необходима и репликация центриолей, которые впоследствии должны обеспечить расхождение хромосом (Fu et al., 2015). Сам процесс репликации центриолей можно разделить на 4 этапа, которые включают разъединение центриолей, инициацию удвоения центриолей, удлинение центриолей и созревание центросомы (Pihan, 2013).
В настоящее время считается, что деление центриолей происходит в основном в S-фазе клеточного цикла, и для его начала необходима активация ряда сигнальных путей с вовлечением протеинкиназ, в частности, cdk2. В конце G1, до начала синтеза ДНК, cdk2 ассоциируется с циклином E, что необходимо как для входа в S-фазу, так и для удвоения центросом. Нарушения контроля репликации центриолей, а также их избыточная генерация приводит к аномалиям деления и определения полярности клеток, дефектам пролиферации и способствует онкотрасформациии клеток (Fu et al., 2015).
Создание системы, позволяющей отслеживать динамику репликации центриолей путем прижизненного наблюдения за клетками при помощи флуоресцентной микроскопии и её соотнесение с прогрессией по клеточному циклу и временем репликации ДНК.
- Для наработки векторов, которые в дальнейшем послужили исходным материалом для создания конструкций, была проведена трансформация бактериальных клеток плазмидами, содержащими химерные белки Centrin-GFP и PCNA-RFP и селекция колоний на чашках Петри с соответствующими антибиотиками.
- Полученные клетки E.coli с указанными плазмидами в дальнейшем выращивались в жидкой среде для последующего выделения плазмид методом щелочного лизиса.
- Был проведён дизайн нового вектора, который содержит обе конструкции (Centrin-GFP и PCNA-RFP) на одной плазмиде для их совместной экспрессии, и которая содержит ген как прокариотического, так и эукариотического антибиотика.
- Полученная плазмида использовалась для транфекции эукариотических клеток. Чтобы оценить эффективность системы для определения динамики репликации центриолей в клеточном цикле, были получены флуоресцентные микрофотографии данных клеток.
- Шубернецкая Ольга Сергеевна
- Киреев Игорь Игоревич
